CENTAR ZA REPRODUKCIJU U STOČARSTVU HRVATSKE

Brojač posjeta
You are visitor # 40

I. Majić-Balić, S. Milinković-Tur, J. Piršljin, B. Beer Ljubić, A. Orak, P. Božić

AKTIVNOST GLUTATION PEROKSIDAZE U SPERMI I KRVNOM SERUMU BIKOVA SIMENTALSKE PASMINE


Glutation peroksidaza je enzim koji ima ključnu ulogu u zaštiti stanica od oksidativnih oštećenja uklanjajući vodikov peroksid kao i druge hidroperokside. Porodicu glutation peroksidaza čine četiri izoenzima koji u aktivnom centru sadrže element selen i jedan izoenzim koji ne sadrži selen. Membrana spermija bogata je višestrukonezasićenim masnim kiselinama koje su vrlo osjetljive na oksidaciju pri čemu nastaju lipidski hidroperoksidi. Aktivnost antioksidativnih enzima u citoplazmi spermija je ograničena, te je stoga sastav sjemene plazme vrlo važan u očuvanju integriteta i oplodne sposobnosti spermija.

Mnogobrojni okolišni, fiziološki i genetski čimbenici djeluju na smanjenje kvalitete sperme i mogu dovesti do neplodnosti životinje te je stoga cilj rada bio utvrditi promjene aktivnosti glutation peroksidaze u spermi i krvnom serumu rasplodnih bikova simentalske pasmine različite dobi. Uzorci sperme uzimani su pomoću umjetne vagine, a uzorci krvi punkcijom v. jugularis od dvije skupine bikova: devet mlađih bikova starih između dvije i četiri godine i osam bikova starih između šest i deset godina. Volumen ejakulata, koncentracija spermija te progresivna pokretljivost određeni su u ejakulatu bikova.

U izoliranim spermijima i krvnom serumu bikova određena je aktivnost izoenzima glutation peroksidaze ovisne o selenu (SeGSH-Px), dok je u sjemenoj plazmi određena aktivnost ukupne glutation peroksidaze (ukupna GSH-Px), SeGSH-Px kao i aktivnost glutation peroksidaze neovisne o selenu (neSeGSH-Px). Aktivnost SeGSH-Px u krvnom serumu starijih bikova bila je značajno viša u odnosu na aktivnost kod mlađih životinja (144,63 ± 48,79 U/L odnosno 80,67 ± 31,14 U/L; P<0,01). Usporedbom aktivnosti ukupne GSH-Px i njenih izoenzima u spermijima i sjemenoj plazmi bikova utvrđene su vrlo ujednačene vrijednosti u promatranim skupinama. Ocjenom volumena i koncentracije ejakulata kao i progresivne pokretljivosti spermija u navedene dvije dobne skupine bikova nisu utvrđene značajne razlike. Navedeni rezultati ukazuju da dob utječe na aktivnost glutation peroksidaze u krvnom serumu, no ne i na aktivnost ovog enzima u spermi rasplodnih bikova simentalske pasmina.


Uvod

Razmnožavanje je temeljni proces koji omogućuje životinjama i ljudima prijenos gena na potomstvo. Postoji veliki broj radova koji upućuju na to da stvaranje reaktivnih spojeva kisika (ROS, eng. reactive oxygen species) i njihovo uklanjanje pomoću antioksidansa igra veliku ulogu u plodnosti. U etiologiji mnogobrojnih bolesti pa tako i kao uzrok neplodnosti u ljudi navodi se oksidativni stres. Tijekom oksidativnog stresa ne dolazi samo do poremećaja fluidnosti membrane spermija zbog oksidativnih oštećenja lipida nego i do oštećenja integriteta DNA u jezgri spermija (Agarwal i sur., 2003). Ova oštećenja mogu ubrzati proces apoptoze zametnih stanica dovodeći do smanjenja broja spermija, smanjenja kvalitete sjemena i neplodnosti.

Neka od opisanih oksidativnih oštećenja mogu biti uklonjena, no spermiji su stanice s vrlo ograničenim antioksidativnim kapacitetom zbog svoje specifične građe. Naime, aktivnost antioksidativnih citoplazmatskih enzima je vrlo niska (Aitken i sur., 1989) što spermije čini jedinstvenim s obzirom na stupanj osjetljivosti na oksidativni stres. Nadalje, plazmatska membrana spermija sisavaca bogata je višestrukonezasičenim masnim kiselinama te je osjetljiva na oštećenja izazvana ROS pri čemu se razvija lipidska peroksidacija (Sikka, 1996).

U antioksidativnoj zaštiti spermija sudjeluje veliki broj antioksidativnih spojeva u samoj stanici kao i u sjemenoj plazmi koji kompenziraju mali antioksidativni kapacitet samih spermatozoa (Agarwal i sur., 2003). Naročitu važnost imaju enzimi glutation peroksidaza (Imai i sur., 2001; Vaisberg i sur., 2005), superoksid dismutaza, katalaza kao i glutation (Imai i sur., 2001).

Glutation peroksidaza je enzim koji ima ključnu ulogu u zaštiti stanica od oksidativnih oštećenja uklanjajući vodikov peroksid i organske hidroperokside (Michiels i sur., 1994). Porodicu glutation peroksidaza čine četiri izoenzima koji u aktivnom centru sadrže element selen i jedan izoenzim koji ne sadrži selen (Halliwell i Gutteridge, 1999).

Mnogobrojni okolišni, fiziološki i genetski čimbenici djeluju na smanjenje kvalitete sperme i mogu dovesti do neplodnosti životinje te je stoga cilj rada bio utvrditi promjene aktivnosti glutation peroksidaze u spermi i krvnom serumu rasplodnih bikova simentalske pasmine različite dobi.

Materijali i metode

Istraživanje je provedeno na 17 bikova simentalske pasmine. Životinje su grupirane u dvije skupine: devet mlađih bikova starih između dvije i četiri godine i osam bikova starih između šest i deset godina. Bikovi su držani u jednakim hranidbenim i smještajnim uvjetima tijekom istraživanja. Hranjeni su dva puta dnevno sa 8 kg krmne smjese, oko 10 kg livadnog sijena, 6 kg sjenaže, slame po volji, te im je na raspolaganju bila stočna sol (MISSOL KR) za lizanje. Bikovi su napajani pomoću automatskih pojilica.

Uzorci sperme uzimani su pomoću umjetne vagine, a uzorci krvi punkcijom v. jugularis. Serum je dobiven centrifugiranjem krvi na 1500 g/15 minuta. Sjemena plazma je odvojena nakon centrifugiranja uzoraka sperme na 1000 g/15 minuta. Talog spermija je resuspendiran u destiliranoj vodi kako bi se izazvala liza spermija te je uzorak centrifugiran 3000 g/15 minuta.

Volumen ejakulata, koncentracija spermija te progresivna pokretljivost određeni su u ejakulatu bikova. Volumen polučenih ejakulata određivao se očitavanjem na graduiranom spermoprimaču. Koncentracija spermija u ejakulatima određena je elektronskim brojačem «PHOTOMETAR SDM 5-mini tub». Progresivna pokretljivost spermija ocjenjena je binokularnim mikroskopom «OLYMPUS» model BX 50 F s ugrađenim spermotermom.

U izoliranim spermijima i krvnom serumu bikova određena je aktivnost izoenzima glutation peroksidaze ovisne o selenu (SeGSH-Px) metodom po Paglia and Valentine (1967), dok je u sjemenoj plazmi određena aktivnost ukupne glutation peroksidaze (ukupna GSH-Px) metodom po Lawrence i Burku (1976), SeGSH-Px kao i aktivnost glutation peroksidaze neovisne o selenu (neSeGSH-Px). Aktivnost neSeGSH-Px izračunata je kao razlika ukupne GSH-Px i SeGSH-Px.

Aktivnost glutation peroksidaze u izoliranim spermijima i sjemenoj plazmi izražena je po gramu bjelančevina koje su određene metodom po Lowry i sur. (1951) s goveđim albuminom kao standardom.
Rezultati su prikazani kao srednja vrijednost ± standardna devijacija. Značajnost razlika među rezultatima provjerena je t-testom i Mann-Whitney U testom, korištenjem računalnog programa Statistica 7.1. Razlike se smatraju statistički značajnim ako je p < 0,05.

Rezultati

Rezultati aktivnosti glutation peroksidaze u spermijima, sjemenoj plazmi i krvnom serumu bikova su prikazani su tablici 1.
Aktivnost SeGSH-Px u krvnom serumu starijih bikova bila je značajno viša u odnosu na aktivnost kod mlađih životinja (144,63 ± 48,79 U/L odnosno 80,67 ± 31,14 U/L; P<0,01). Usporedbom aktivnosti ukupne GSH-Px i njenih izoenzima u spermijima i sjemenoj plazmi bikova utvrđene su vrlo ujednačene vrijednosti u promatranim skupinama.


Tablica 1. Aktivnost glutation peroksidaze u spermijima, sjemenoj plazmi i krvnom serumu bikova

Stariji bikovi (n=8) Mlađi bikovi (n=9) P<
Spermiji
(U/g bjelanč.) SeGSH-Px 833,42 ± 495,42 602,33 ± 150,26 ns
Sjemena plazma
(U/g bjelanč.) Ukupna GSH-Px 1359,96 ± 337,97 1368,03 ± 179,89 ns
SeGSH-Px 418,72 ± 163,08 448,89 ± 93,47 ns
neSeGSH-Px 941,23 ± 239,82 919,14 ± 156,79 ns
Krvni serum (U/L) SeGSH-Px 144,63 ± 48,79 80,67 ± 31,14 0,01


Rezultati volumena ejakulata, koncentracije i progresivne pokretljivosti spermija bikova prikazani su tablici 2. Ocjenom volumena i koncentracije ejakulata kao i progresivne pokretljivosti spermija u navedene dvije dobne skupine bikova nisu utvrđene značajne razlike (p>0,05).




Tablica 2. Volumen ejakulata, koncentracija i progresivna pokretljivost spermija bikova

Stariji bikovi (n=8) Mlađi bikovi (n=9) P
Volumen ejakulata (ml) 4,73 ± 2,72 2,84 ± 1,08 ns
Koncentracija spermija (*109/ml) 1,25 ± 0,28 1,18 ± 0,30 ns
Progresivna pokretljivost (%) 80,00 ± 9,01 79,50 ± 11,41 ns


Rasprava

Pod utjecajem brojnih okolišnih, genetskih čimbenici kao i dobi dolazi do smanjenje kvalitete sperme i neplodnosti kod ljudi (Sikka, 1996). Rutinske analize sjemena podrazumijevaju makroskopsku (volumen, boja, miris, konzinstencija) i mikroskopsku (pokretnjivost, morfološke osobitosti, koncentracija spermija) ocjenu. Na osnovi rezultata ovih analiza uzorci sjemena bikova se uzimaju za duboko smrzavanje ili se odbacuju kao nedovoljno kvalitetni. U ovom istraživanju rezultati volumena ejakulata, koncentracije spermija i progresivne pokretljivosti u obje skupine bikova su bile ujednačene.

Neka istraživanja pokazuju da je ocjena kvalitete sjemena samo na osnovi makroskopskog i mikroskopskog pregleda nedostatna te se predlaže određivanje dodatnih biokemijskih pokazatelja u spermijima i sjemenoj plazmi. Kako oksidativni stres igra veliku ulogu u plodnosti životinja za procijenu kvalitete uzoraka sperme raspoldnih bikova u radu smo određivali aktivnost glutation peroksidaze.

Za održavanje plodnosti naročito je važna fosfolipid hidroperoksidna glutation peroksidaza (Vaisberg i sur., 2005), izoenzim ovisan o selenu koji ima ulogu u spermatogenezi i funkciji spermija, a smanjena aktivnost dovodi do smanjene plodnosti (Imai i sur., 2001; Imai i Nakagawa, 2003.). Aktivnost glutation peroksidaze u spermi rasplodnih bikova u korelaciji je s progresivnom pokretljivošću spermija (Vaiseberg i sur., 2005).

U ovom istraživanju u sjemenoj plazmi bikova utvrđena je dvostruko veća aktivnost izoenzima glutation peroksidaze neovisne o selenu u usporedbi s izoenzimima ovisnim o selenu što je u skladu s rezultatima Bilodeau i sur. (2000).

U radu je određena aktivnost glutation peroksidaze ovisne o selenu u krvnom serumu te je utvrđeno da njena aktivnost sa dobi raste.

Navedeni rezultati ukazuju da dob utječe na aktivnost glutation peroksidaze u krvnom serumu, no ne i na aktivnost ovog enzima u spermi rasplodnih bikova simentalske pasmina.


Literatura

Agarwal, A., A. Ramadan, M. D. Saleh, M. A. Bedaiwy (2003): Role of reactive oxygen species in the pathophysiology of human reproduction. Fert. Steril. 4, 829-843.

Aitken, R. J., J. S. Clarkson, S. Fishel (1989): Generation of Reactive Oxygen Species, Lipid Peroxidation, and Human Sperm Function. Biol. Reproduct. 40, 183-197.

Bilodeau, J. F., S. Chatterjee, M. A.´ Sirard, C. Gagnon (2000): Levels of antioxidant defenses are decreased in bovine spermatozoa after a cycle of freezing and thawing. Mol. Reproduct evelopm 55, 282–288.

Halliwell, B., J. M. C. Gutteridge (1999): Free radicals in biology and medicine. 3rd edition. Oxford University Press, 134-140.

Imai, H., K. Suzuki, K. Ishizaka, S. Ichinose, H. Oshima, I. Okayasu, K. Emoto, M. Umeda, Y. Nakagawa (2001): Failure of the Expression of Phospholipid Hydroperoxide Glutathione Peroxidase in the Spermatozoa of Human Infertile Males. Biol. Reproduct. 64, 674–683.

Imai, H., Y. Nakagawa (2003): Biological significance of phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase (PHGPx, GPx4) in mammalian cells. Free Rad. Biol. Med. 2, 145-169.

Lawrence, R. A., R. F. Burk (1976): Glutathione peroxidase activity in selenium-deficient rat liver. Biochem. Biophis. Res. Com. 4, 952-958.

Lowry, O. H., N. J. Rosebrough, A. L. Farr, R. J. Rendal (1951): Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193, 265-267.

Michiels, C. M., M. Raes, O. Toussaint, J. Remacle (1994): Importance of Se-lutathione peroxidase, catalase and Cu/Zn-SOD for cell survival against oxidative stress. Free Rad. Biol. Med. 17, 235-248.

Paglia, D. E, W. N Valentine (1967): Studies on the quantitative and qualitative characterization of erythrocyte peroxidase. J Lab Clin Med 1, 158-169.

Sikka, S. C. (1996): Oxidative stress and role of antioxidants in normal and abnormal sperm function. Frontiers in Bioscience 1, 78-86.

Vaisberg, C. N., L. V. Jelezarsky, B. Dishlianova, T. A. Chaushev (2005): Activity, substrate detection and immunolocalization of glutathione peroxidase (GPx) in bovine reproductive organs and semen. Theriogenology 2, 416-428.